Nghiên cưu đặc trưng Protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú

v
TÓM TẮT

ĐẶNG TRỊNH MINH ANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006.
“NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ
ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus
vannamei)”
Hội đồng hướng dẫn:
 TS. Văn Thị Hạnh
 TS. Nguyễn Ngọc Hải
 CN. Lê Phúc Chiến
Khoá luận được thực hiện tại Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh
Học Nhiệt Đới là 1 phần của đề tài “Nghiên cứu hội trứng Taura ở tôm thẻ chân
trắng và mối liên quan với tác nhân gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm càng
xanh”. Nguồn virus ban đầu đã được phòng thí nghiệm phân lập và nhân lên trong tế
bào côn trùng Sf9.
Nội dung của khoá luận là: Xác định đặc trưng protein của Red - Tail Virus
(RTV) bằng kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot. Sau đó kiểm tra khả năng gây
nhiễm thực nghiệm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng của RTV được nhân lên trong tế
bào côn trùng Sf9. Bước tiếp theo là tiến hành thăm dò khả năng phân tách các thành
phần protein của virus bằng phương pháp sắc ký lọc gel để phục vụ cho những nghiên
cứu tiếp theo.
Những kết quả thu được:
1. Sử dụng RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ chân trắng được nhân lên trong tế bào
côn trùng Sf9 gây nhiễm trở lại cho tôm sú và tôm thẻ thành công.
2. Xác định được các protein của RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ được nuôi cấy
trong tế bào côn trùng Sf9 bằng kỹ thuật điện di gel Sodium dodecyl sulfate –
Polyacrylamide (SDS-PAGE) và điện di miễn dịch (Western Blot)







vi
MỤC LỤC

PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iv
Tóm tắt . v
Mục lục .vi
Danh mục các chữ viết tắt ix
Danh mục các hình .x
Danh mục các bảng .xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3
2.1.1 Hiện trạng chung 3
2.1.2 Thiệt hại do TSV trên thế giới 4
2.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam 4
2.2.1 Hiện trạng chung 4
2.2.2 Thiệt hại do TSV tại Việt Nam 5
2.3 Giới thiệu hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 6
2.3.1 Lịch sử và phân bố hội chứng Taura 6
2.3.2 Phân loại và tên gọi 7
2.3.2.1 Tên gọi 7
2.3.2.2 Vị trí phân loại 7
2.3.3 Đặc điểm cấu trúc và genom của TSV 7
2.3.4 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm 8
2.3.5 Vật chủ 9
2.3.6 Sự đa dạng di truyền và sự xuất hiện các chủng TSV mới 10
2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền của TSV 10
2.3.6.2 Sự xuất hiện các chủng TSV mới 10





vii
2.3.7 Khả năng lây truyền của virus Taura 12
2.3.8 Một số đặc tính của virus Taura với các yếu tố lý hóa 12
2.4 Các phương pháp và kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura 13
2.4.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng 13
2.4.2 Phương pháp mô học 14
2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm sinh học 14
2.4.4 Phương pháp miễn dịch 14
2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) 14
2.4.6 Phương pháp RT-PCR 15
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ và vật liệu 16
3.2.1 Hóa chất 16
3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel 16
3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE 16
3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel 16
3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting 16
3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot 17
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ 17
3.2.3 Vật liệu 18
3.2.3.1 Kháng thể 18
3.2.3.1 Mẫu 18
3.3 Phương pháp 18
3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE 18
3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE 18
3.3.1.1 Nguyên tắc 18
3.3.1.2 Phương pháp tiến hành 20
3.3.2 Phương pháp Western Blot 21





viii
3.3.2.1 Nguyên tắc 21
3.3.2.2 Phương pháp tiến hành 23
3.3.3 Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ (Penaeus
vannamei) bằng RTV được nhân lên trong tế bào Sf9 26
3.3.4 Phương pháp Dot Blot 27
3.3.4.1 Nguyên tắc 27
3.3.4.2 Phương pháp tiến hành 27
3.3.5 Phương pháp sắc ký 28
3.3.5.1 Nguyên tắc 28
3.3.5.2. Phương pháp tiến hành 29
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30
4.1 Kết quả SDS – PAGE 30
4.2 Kết quả Western Blot 32
4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm 34
4.4 Kết quả Dot Blot chỉ thị virus 37
4.5 Kết quả sắc ký lọc gel 40
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42
5.1 Kết luận 42
5.2 Đề nghị 42
PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
PHỤ LỤC 1 47
PHỤ LỤC 2 48
PHỤ LỤC 3 50
PHỤ LỤC 4 52





ix
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1. APS Ammmonium persulphate
2. bp: Base pair
3. DNA: Deoxyribonucleic acid
4. DAB: 3,3’- Diaminobenzidinetetrahydrochloride
5. LOS: Lymphoid Organ Syndrome
6. IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus
7. MBV: Monodon Baculovirus
8. Kb: Kilo base
9. KDa: Kilo Dalton
10. PAb: Polyclonal Antibody
11. PBS: Phosphate Buffered Saline
12. PCR: Polymerase Chain Reaction
13. PL: Post larvae
14. RNA: Ribonucleic acid
15. RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
16. RTV: Red - Tail Virus
17. ORF: Open Reading Frame
18. OIE: Office International Des Epizooties (Tổ chức dịch tễ thế giới)
19. SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
20. Sf9: Sepodoptera frugiperda
21. SPF: Specific Pathogen Free (Sạch bệnh)
22. TCT: Tôm thẻ chân trắng
23. TEMED: N, N, N’, N’ – tetramethylethylenediamine
24. TTBS: Tween tris buffer saline
25. TSV: Taura Syndrome Virus
26. YHV Yellow Head Virus
27. WSSV: White Spot Syndrome Virus






x
DANH MỤC CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1: Sự phân bố của TSV trên thế giới 6
Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của TSV 8
Hình 2.3: Tôm bị nhiễm TSV 9
Hình 2.4: cây phát sinh loài của 40 phân lập TSV dựa vào trình tự aa của VP2 10
Hình 2.5: Cây phát sinh loài theo đoạn ORF2 (1011aa) của 6 chủng TSV 11
Hình 3.1: Các bước thực hiện Western Blot 21
Hình 3.2: Cách lắp ráp gel và màng nitrocellulose 22
Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch 28
Hình 4.1: Kết quả SDS – PAGE 30
Hình 4.2: Kết quả Western Blot 32
Hình 4.3: Tôm thẻ không gây nhiễm và tôm thẻ gây nhiễm 34
Hình 4.4: Tôm thẻ chết do gây nhiễm thực nghiệm với RTV 35
Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tôm sú đối chứng nuôi trong phòng thí nghiệm (x40) 36
Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV . 36
Hình 4.7: Ảnh chụp hiển vi phần đuôi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào
nhiễm RTV 36
Hình 4.8: Tôm sú giống gây nhiễm nhiễm thực nghiệm với RTV 37
Hình 4.9: Chỉ thị mức độ bệnh theo phương pháp Dot Blot 37
Hình 4.10: Kết quả kiểm tra tôm thẻ trước khi gây nhiễm 38
Hình 4.11: Kết quả kiểm tra tôm sú giống trước khi gây nhiễm 38
Hình 4.12: Kết quả kiểm tra tôm thẻ sau khi gây nhiễm 38
Hình 4.13: Kết quả kiểm tra tôm sú giống sau khi gây nhiễm 39
Hình 4.14: Kết quả dịch tế bào (DTB) Sf9 40
Hình 4.15: Kết quả DTB nhiễm virus từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA).40
Hình 4.16: Kết quả DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh RTV (RTV-PvM) .
41






xi

DANH MỤC CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1: Sản lượng tôm tôm thế giới năm 2002-2003 3
Bảng 2.2: Sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam qua các năm 5
Bảng 2.3: Các phương pháp chuẩn đoán TSV 13
Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng 18
Bảng 4.1: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi SDS-PAGE và trọng
lượng của các protein đã được công bố 31
Bảng 4.2: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi Western Bloting và trọng
lượng của các protein đã được công bố 33
Bảng 4.3: Số tôm thẻ sống sót sau ba tuần gây nhiễm 34
Bảng 4.4: Số tôm sú sống sót sau hai tuần gây nhiễm 35
1




1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU

Nuôi tôm đang là thế mạnh của ngành thủy sản nước ta. Từ năm 1995 nghề
nuôi tôm nước ta phát triển mạnh mẽ cả về diện tích, hình thức nuôi, năng suất, sản
lượng và hiệu quả kinh tế. Cụ thể là năm 2004 diện tích tôm nuôi đạt hơn 460.000ha,
tổng sản lượng đạt 350.000 tấn và là nguồn cung cấp nguyên liệu quan trọng cho chế
biến xuất khẩu thủy sản. Nghề nuôi tôm đã thực sự trở thành một trong những nghề
sản xuất hàng hóa lớn của Việt Nam.
Tuy nhiên cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm, dịch bệnh do virus gây ra
cũng liên tục lan rộng và gây thiệt hại nặng nề về kinh tế. Trong khi đó, những nghiên
cứu về virus tôm còn rất hạn chế. Vì vậy, việc nghiên cứu tác nhân virus gây bệnh
nhằm đề xuất giải pháp hạn chế tác nhân này là một yêu cầu cấp bách hiện nay.
Bên cạnh đó, việc khai thác tiềm năng và phát triển thêm các chủng loại tôm
nuôi khác để đa dạng hóa các sản phẩm tôm thương mại, tận dụng tối đa điều kiện tự
nhiên và nhân lực ở các vùng ven biển cũng là vấn đề hiện đang rất được nhà nước
quan tâm. Năm 2001 Việt Nam bắt đầu du nhập tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) từ
Đài Loan và Hawaii vào nuôi thử nghiệm ở một số vùng. Tôm thẻ chân trắng có những
ưu thế so với tôm sú như chủ động về nguồn giống, thời gian nuôi ngắn hơn nhưng
năng suất tương đương tôm sú, chịu được độ mặn cao và có thể nuôi được trong cả
nước mặn, ngọt và lợ… Tuy nhiên việc nhập nuôi loài tôm này gắn liền với việc đưa
virus hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV) vào Việt Nam. Để tránh không
xảy ra dịch bệnh như đã có đối với các nước từng du nhập tôm thẻ chân trắng (TCT)
thì những thông tin đầy đủ về bệnh hội chứng Taura và khả năng lây lan TSV từ tôm
này sang các loài tôm bản địa khác, đặc biệt đối với tôm sú, cũng là vấn đề rất được
quan tâm.
Năm 2000 Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới thu
được mẫu tôm sú ở Long An nghi nhiễm TSV, với biểu hiện lâm sàng là đỏ đuôi quạt
và đỏ 2 đốt thân cuối. Tôm còn sống nhưng vận động và tiêu thụ thức ăn kém. Các
mẫu tương tự sau đó đã thu được ở Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh. Năm 2003 phòng thí
nghiệm cũng thu được mẫu tôm TCT với biểu hiện lâm sàng tương tự. Tất cả các mẫu
tôm này đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cho kết quả âm tính WSSV
2




2
(White Spot Syndrome Virus), IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic
Necrosis Virus), MBV (Monodon Baculovirus), YHV (Yellow Head Virus). Các kết
quả nghiên cứu về đặc trưng sinh hóa, sinh học phân tử, cấu trúc hiển vi điện tử ở
phòng thí nghiệm khẳng định tác nhân gây bệnh chính là virus.
Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ
đuôi ở tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” là
cần thiết và cấp bách nhằm xác định mối liên hệ giữa tác nhân gây bệnh đỏ đuôi đặc
biệt này và virus hội chứng Taura ở tôm thẻ chân trắng để có biện pháp phòng ngừa
kịp thời.
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và
tôm TCT.
Yêu cầu thực hiện của đề tài
Đề tài thực hiện gồm 3 nội dung như sau:
Nội dung 1: Xác định các protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi.
Nội dung 2: Kiểm tra khả năng gây nhiễm thực nghiệm của virus gây hội chứng
đỏ đuôi được nhân trong tế bào côn trùng Sf9 trên tôm sú và tôm thẻ chân
trắng.
Nội dung 3: Thăm dò khả năng phân tách các thành phần protein của virus bằng
phương pháp sắc ký lọc gel.

3




3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
2.1.1 Hiện trạng chung
Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong
những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trên thế
giới. Vào những năm cuối thập kỷ 80, nghề nuôi tôm đã có những bước phát triển
nhanh chóng, các trại nuôi tôm được xây dựng ở gần 40 nước, đưa sản lượng tôm nuôi
từ tỷ lệ 2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với tổng sản lượng tôm (Latscha, 1989).
So với năm 1984, sản lượng tôm nuôi năm 1990 tăng 368% với gần 600.000 tấn
(FAO, 1992). Năm 2003, sản lượng tôm nuôi trên thế giới gia tăng nhanh chóng. Đứng
đầu là Trung Quốc với 400.000 tấn, kế đến là Thái Lan 350.000 tấn so với năm 2002,
Việt Nam xếp thứ 3 với 200.000 tấn. Trong đó các nước Đông Bán Cầu chiếm 70%
tổng sản lượng tôm nuôi, còn lại là các nước Tây Bán Cầu.
Bảng 2.1: Sản lượng tôm thế giới năm 2002 – 2003

Quốc gia Năm 2002 Năm 2003
Trung Quốc 280.000 400.000
Thái Lan 250.000 350.000
Việt Nam 150.000 200.000
Indonesia 102.000 168.000
Ấn Độ 125.000 160.000
Malaysia 20.000 32.000
Trung và Nam châu Mỹ 93.000 320.000
Các quốc gia khác 225.000 270.000
Tổng cộng 1.245.800 1.900.000
Nguồn: Thông tin hội thảo kỹ thuật nuôi tôm sú (2005)

Xem chi tiết: Nghiên cưu đặc trưng Protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú