Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
54
3. THỰC NGHIỆM
3.1 Điều kiện thực nghiệm
Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại bi được thực hiện với các
điều kiện sau:
¾ Nguyên liệu:
Toàn cây đại bi thu hái tại Đà Lạt (Lâm Đồng) vào tháng 12 năm 2006, được
ThS. Nguyễn Duy Chính, bộ môn Tài nguyên và Môi trường, đại học Đà Lạt nhận
danh. Xay toàn cây thành mảnh nhỏ dùng để làm mẫu nguyên liệu cho nghiên cứu.
¾ Sắc ký cột:
Silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60F
254
).
Silica gel pha đảo (RP silica gel) (Cosmisil 75 C
18
- OPN), Nacalai Tesque
Inc., Kyoto).
¾ Sắc ký lớp mỏng:
Silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60 F
254
, dày 0,25 hay 0,50 mm).
Silica gel pha đảo RP
18
(Whatman, KC
18
F, dày 0,25 hay 0,50 mm).
¾ Thuốc thử:
Dung dịch Ce(SO
4
)
2
trong H
2
SO
4
10%.
¾ Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Máy Bruker Avance 500 [500 MHz (
1
H) và 125 MHz (
13
C)].
Máy Jeol JNM - LA 400 [400 MHz (
1
H) và 100 MHz (
13
C)].
¾ Đèn UV:
Produkte fur die Biotechnololie, bước sóng 254-365 nm.
¾ Dung môi sử dụng:
Hexan (Trung Quốc, Labscan).
Metanol (Trung Quốc, Labscan).
Cloroform (Trung Quốc, Labscan).
Acetonitril (Merck).
Etyl acetat (Trung Quốc).
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
55
Nước cất.
H
3
PO
4
(Trung Quốc).
NaOH (Trung Quốc).
Na
2
HPO
4
.12H
2
O (Trung Quốc).
NaH
2
PO
4
.2H
2
O (Trung Quốc).
Etanol (99,7%) (Trung Quốc).
HCl (Trung Quốc).
Bovine milk xanthine oxidase (Sigma).
Xanthine (Kanto chemical Co. INC).
Allopurinol (Sigma).
3.2 Ly trích cao thô
Cây đại bi xay nhỏ được chia làm nhiều phần và được trích nóng với metanol
bằng phương pháp đun hoàn lưu. Mỗi lần trích khoảng 250 gam với 1,5 lít metanol,
đun hoàn lưu trong ba giờ. Mỗi phần trích 3 lần. Toàn bộ dịch trích thu được đem
cô quay áp suất kém, thu được cao metanol thô.
Cao metanol thô cho phân tán trong nước cất và lần lượt chiết với các dung
môi hexan, cloroform, etyl acetat thu được các cao tương ứng: cao hexan, cao
CHCl
3
, cao EtOAc và cao H
2
O.
Quy trình ly trích các cao được trình bày trong sơ đồ 3.1.
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
56
Sơ đồ 3.1 - Quy trình ly trích các cao từ cây đại bi.
Cây đại bi
(2,0 kg)
Cao MeOH
(180 g)
- Trích nóng với MeOH
- Lọc
- Thu hồi dung môi
- Hòa tan với nước
- Trích với hexan
Dịch hexan
Dịch nước
Thu hồi dung môi
Cao hexan
(57,6 g)
Dịch CHCl
3
Thu hồi dung môi
Cao CHCl
3
(68,4 g)
Dịch nước
Trích với EtOAc
Dịch EtOAc
Dịch nước
(15,3 g)
Thu hồi dung môi
Cao EtOAc
(32,4 g)
Trích với CHCl
3
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
57
3.3 Quá trình cô lập
Trong luận văn này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao
CHCl
3
và EtOAc được trích từ cây đại bi.
3.3.1 Cao CHCl
3
Thực hiện sắc ký cột cao CHCl
3
(57,6 g) trên silica gel với hệ giải ly
cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%,
20%) dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO
4
)
2
đun nóng, chúng
tôi gom thành 4 phân đoạn (F1-F4).
Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F2 (9,1 g) với hệ dung ly
cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH), dựa trên sắc ký lớp
mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO
4
)
2
đun nóng thu được sáu phân đoạn (F2.1-
F2.6). Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F2.3 (2,5 g) với hệ dung ly
cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH) thu được 5 phân
đoạn (F23.1-F23.5). Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha đảo phân đoạn F23.2
(354 mg) và F23.3 (612 mg) với hệ dung ly acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu
được hợp chất (1) và (2) (sơ đồ 3.2).
Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F3 (11,2 g) v
ới hệ dung ly
cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH), dựa trên sắc ký lớp
mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO
4
)
2
thu được năm phân đoạn (F3.1-F3.5). Sắc
ký cột hấp phụ trên silica gel pha đảo phân đoạn F3.2 (1,2 g) với hệ dung ly
acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu được hợp chất (4) (sơ đồ 3.3).
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
58
Sơ đồ 3.2 - Quy trình cô lập hợp chất (1) và (2) từ cao CHCl
3
.
F23.2
(354 mg)
F2
(9,1 g)
F2.3
(2,5 g)
SKC trên silica gel CHCl
3
-MeOH (0-15%),
thu được 6 phân đoạn (F2.1-F2.6)
SKC trên silica gel CHCl
3
-MeOH (0-10%),
thu được 5 phân đoạn (F23.1-F23.5)
SKC pha đảo hệ dung môi
CH
3
CN:MeOH:H
2
O (1:1:4)
Hợp chất (1)
(6,7 mg)
F23.3
(612 mg)
SKC pha đảo, hệ dung môi
CH
3
CN:MeOH:H
2
O (1:1:4)
Hợp chất (2)
(8,3 mg)
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
59
Sơ đồ 3.3 - Quy trình cô lập hợp chất (4 ) từ cao CHCl
3
.
3.3.2 Cao
EtOAc
Thực hiện sắc ký cột cao EtOAc (32,4 g) trên silica gel với hệ giải ly
cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%,
20%) dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO
4
)
2
, chúng tôi gom
thành 7 phân đoạn (F1-F7).
Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F3 (4,6 g) với hệ dung ly
cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-20% MeOH), dựa trên sắc ký lớp
mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO
4
)
2
thu được bốn phân đoạn (F3.1-F3.4). Sắc
ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F3.2 (2,3 g) với hệ dung ly acetonitril :
metanol : nước (1:1:4), thu được hai hợp chất (6) và hợp chất (7) (sơ đồ 3.4). Sắc ký
cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F3.4 (820 mg) với hệ dung ly acetonitril :
metanol : nước (1:1:4), thu được hợp chất (3) (sơ đồ 3.4).
Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F4 (3,5 g) vớ
i hệ dung ly
cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-20% MeOH), dựa trên sắc ký lớp
mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO
4
)
2
thu được năm phân đoạn (F4.1-F4.5). Sắc
ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F4.2 (550 mg) với hệ dung ly acetonitril :
metanol : nước (1:1:4), thu được hợp chất (5) (sơ đồ 3.5).
F3
(11,2 g)
F3.2
(1,2 g)
Hợp chất (4)
(9,2 mg)
SKC, hệ CHCl
3
: MeOH (0-15%)
thu được 5 phân đoạn (F3.1-F3.5)
SKC pha đảo hệ dung môi
CH
3
CN:MeOH:H
2
O (1:1:4)
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
60
Sơ đồ 3.4 - Quy trình cô lập hợp chất (3), (6), (7) từ cao EtOAc.
Hợp chất (6)
(14,6 mg)
F3.4
(820 mg)
F3.2
(2,3 g)
SKC, CH
3
CN:MeOH: H
2
O
(1:1:4)
SKC, CH
3
CN:MeOH: H
2
O
(1:1:4)
F3
( 4,6 g)
SKC, hệ CHCl
3
:MeOH (20%)
thu được 4 phân đoạn (F3.1-F3.4)
Hợp chất (7)
(20 mg)
Hợp chất (3)
(7,2 mg)
Sơ đồ 3.5 - Quy trình cô lập hợp chất (5) từ cao EtOAc.
F4
(3,5 g)
F4.2
(550 mg)
SKC, CH
3
CN: MeOH: H
2
O (1:1:4)
SKC, CHCl
3
: MeOH (20%)
thu được 5 phân đoạn (F4.1- F4.5)
Hợp chất (5)
(6,3 mg)
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
61
3.4 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym XO
3.4.1 Nguyên tắc
Xanthine oxidase là một enzym thân oxi hóa, xúc tác phản ứng oxi hóa
xanthine tạo acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O
2
●
. Phương pháp thử XO
sử dụng phương pháp trắc quang khảo sát khả năng ức chế enzym XO của các mẫu
thử thông qua mật độ quang của sản phẩm acid uric hình thành. Acid uric có bước
sóng cực đại hấp thu tại 290 nm. Chất có khả năng kháng enzym XO càng cao sẽ
càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó mật độ quang của mẫu đo được sẽ giảm.
Hình 3.1 - Phản ứng tạo acid uric.
3.4.2 Chuẩn bị hóa chất
• Đệm phosphat 70 mM, pH = 7,5: cân 3,702 g NaH
2
PO
4
.2H
2
O và 16,57 g
Na
2
HPO
4
.12H
2
O
định mức thành 1000 ml bằng nước cất 2 lần. Dùng NaOH
và H
3
PO
4
điều chỉnh pH đến 7,5 bằng máy pH.
• Xanthine oxidase 0,05 U/ml: pha từ XO 25 U/ml theo nguyên tắc pha loãng
(Một units (U) của XO được định nghĩa là một lượng enzym cần thiết để tạo
ra 1 µmol của acid uric trong 1 phút ở 25
0
C).
• Xanthine 150 µM: cân chính xác 1,14 mg xanthine, pha trong bình định mức
50 ml bằng đệm phosphat 70 mM pH=7,5.
• HCl 1N: rút 16,7 ml HCl đậm đặc (37 %) thêm nước cất 2 lần thành 200 ml.
• Dung dịch mẫu làm việc có nồng độ 500 μM.
Xanthine
Acid uric
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
62
Sơ đồ 3.6 - Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym XO.
Mẫu thử và mẫu control được pha theo bảng sau:
C (μM) control 100 50 25 10
V
1 mẫu
(μl)
0 600 300 150 60
V
2 đệm
(μl)
1800 1200 1500 1650 1740
V
XO
(μl)
100
V
xanthine
(μl)
900
V
HCl 1N
(μl)
200
Tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank). Mẫu trắng
tương tự như mẫu thử nhưng thay 100 μl XO bằng 100 μl đệm.
Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát đối với enzym
XO, chúng tôi sử dụng allopurinol làm chất đối chứng dương. Đây là một hợp chất
ức chế enzym XO rất tố
t, đã được sử dụng làm thuốc để chữa trị bệnh gút.
V
1
μl mẫu (500 μM)
V
2
µl đệm pH 7,5
Dung dịch sau ủ lần 2
Dung dịch sau ủ
- 100 μl XO (0,05U/ml)
- Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng
- 900 μl Xanthine 150 μM
- Ủ lần 2
(30 phút)
- 200 μl HCl 1N
Đo tại λ= 293 nm
Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (Blumea balsamifera), họ cúc (Asteraceae)
HVCH: Nguyễn Thị Mai Hương GVHD: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
63
Hình 3.2 – Công thức cấu tạo của allopurinol.
3.4.3 Chuẩn bị mẫu
Mẫu khảo sát được cân sau đó sẽ được hòa tan trong dung dịch đệm phosphat
pH 7,5.
Khả năng chống oxi hoá của các hợp chất được tính dựa trên phần trăm ức chế
(%I). Phần trăm ức chế (%I) được xác định theo công thức:
Với :
− Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu thử (control).
− As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu thử (sample).
Mỗi mẫu ban đầu được thử ở bốn nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µM. Mỗi
nồng độ được tiến hành 3 lần, ứng với mỗi nồng độ ta tính được 3 giá trị % ức chế
(%I). Lấy trung bình 3 giá trị %I từ đ
ó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế
ứng với từng nồng độ khảo sát. Nếu hoạt tính của mẫu thử ức chế trên 50% ở 10
µM thì sẽ được thử tiếp ở các nồng độ nhỏ hơn 5, 2, 1, 0.5, 0.2 µM để tìm ra giá trị
IC
50
.
3.4.4 IC
50
và cách xác định
Định nghĩa :
IC
50
là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu
khảo sát. IC
50
được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50%
gốc tự do hoặc enzym. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC
50
sẽ càng thấp.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét